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EF21A\J1                      2016-01版

孔雀石綠

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物孔雀石綠將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗孔雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物孔雀石綠的含量。

二、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：   0.05ppb
2. 孵育溫度：       25℃
3. 孵育時間：       30min～30min～15min
4. 樣本檢測限

水樣      ·······································  0.1ppb

水產品    ·······································  0.5ppb    

1. 交叉反應率

顯性孔雀石綠  ·································   100%

隱性孔雀石綠  ································    0.1%

結 晶 紫    ····································    95%

隱性結晶紫  ··································     0.1%

1. 樣本回收率

水樣、水產品  ····························  80%~110%

1. 精密度

板內、板間變異系數≤12%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙腈、二氯甲烷、無水硫酸鈉、正己烷

五、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

1. 樣本前處理需配制：

配液1 樣品提取液  

       乙腈-二氯甲烷混合溶液：

         V_乙腈-V_二氯甲烷  =  4 : 1， 取40ml乙腈，

      再加入10ml二氯甲烷，混勻后使用。

配液2 樣品復溶液

    將4X濃縮復溶液用去離子水按1：3稀釋

   （1份4×濃縮復溶液+3份去離子水），或按所

    需用量配制。

1. 樣本處理：

• 水樣處理方法

   取50µl清澈水樣樣直接測定（如果水樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min，直至得到清澈樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。

樣本稀釋倍數:  1倍

• 水產品處理方法

1. 稱取2±0.05g均質組織樣品于50ml離心管中，加入6ml樣品提取液（配液1），2g無水硫酸鈉，振蕩5min ，室溫（25℃左右）4000r/min以上離心10min；
2. 取3ml上清液，加入20µl氧化劑，搖勻，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；
3. 加入1ml正己烷，加入1ml樣品復溶液（配液2），振蕩搖勻1min，4000r/min以上離心5min；
4. 取下層50 µl用于分析；

樣本稀釋倍數:  1倍

注：此方法所得到的結果為孔雀石綠；隱性孔雀石綠；結晶紫；隱性結晶紫的總量。

六、 酶標免疫分析程序:

1. 測定前應須知：

1. 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3. 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4. 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1. 從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3. 配液1：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液2：

配制孔雀石綠標準液：取一定量的10倍濃縮

標準液用樣品復溶液10倍稀釋，現配現用，

具體如下：

    標準液6：配制4.05ppb標準液--取50ul 40.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻；

    標準液5：配制1.35ppb標準液--取50ul 13.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻；

    標準液4：配制0.45ppb標準液--取50ul 4.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻；

標準液3：配制0.15ppb標準液--取50ul 1.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻；

標準液2：配制0.05ppb標準液--取50ul 0.5ppb標準液加450ul樣品復溶液混勻；

標準液1：配制 0ppb標準液--取50ul 0ppb標

         準液加450ul樣品復溶液混勻；

1. 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
2. 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境中反應30min。
3. 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
4. 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
5. 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。
6. 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含孔雀石綠量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.05ppb為1.816；0.15ppb為1.415；

0.45ppb為0.74；1.35ppb為0.313；4.05ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以孔雀石綠標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

1. 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3. 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4. 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6. 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7. 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。
8. 該試劑盒理想反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲藏條件和保質期

1. 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2. 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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